I.
PENDAHULUAN
Agrobacterium
tumefaciens adalah bakteri patogen pada tanaman yang banyak
digunakan untuk memasukkan gen asing ke dalam sel tanaman untuk menghasilkan
suatu tanaman transgenik. Secara alami, A.
tumefaciens dapat menginfeksi tanaman dikotiledon melalui bagian tanaman yang
terluka sehingga menyebabkan tumor mahkota empedu (crown gall tumor).
Bakteri yang tergolong
ke dalam gram negatif ini memiliki sebuah plasmid besar yang disebut plasmid-Ti yang berisi gen penyandi faktor virulensi penyebab infeksi bakteri ini pada tanaman. Untuk memulai pembentukan
tumor, A. tumefaciens harus menempel terlebih dahulu
pada permukaan sel inang dengan memanfaatkan polisakarida asam yang akan digunakan untuk
mengkoloniasi/menguasai sel tanaman. Selain tanaman dikotiledon,
tanaman monokotiledon seperti jagung, gandum, dan tebutelah digunakan untuk memasukkan sel asing ke dalam genom
tanaman. Agrobacterium tumefaciens adalah bakteri patogen pada tanaman yang
banyak digunakan untuk memasukkan gen asing ke dalam sel tanaman untuk
menghasilkan suatu tanaman transgenik.
Sebagian besar genus Agrobacterium
menyebabkan tumor pada tanaman dikotil. Species Agrobacterium tergolong bakteri
gram negatif yang tergolong bakteri aerob dan mampu hidup baik sebagai saprofit
maupun parasit. Agrobacterium berbentuk batang, berukuran 0,6 – 1,0 µm sampai
1,5 – 3,0 µm, dalam bentuk tunggal atau berpasangan. Agrobacterium merupakan
bakteri yang mudah bergerak (motile) dan memiliki 1-6 flagela peritrichous serta
merupakan bakteri tak berspora. Suhu optimal pertumbuhan bakteri ini adalah
25-28°C. Kumpulan bakteri ini biasanya berbentuk cembung, bulat, lembut, dan
tak berpigmen. Agrobacterium diisolasi
dari tanaman yang terinfeksi Crown Gall. Tumor Crown Gall adalah jaringan
tanaman yang pertumbuhannya tidak terdiferensiasi akibat adanya interaksi
antara tanaman-tanaman yang rentan dengan strain virulen Agrobacterium tumefaciens.
II.
PEMBAHASAN
2.1. Agrobacterium dan
Peranannya dalam Transfer Gen
Transformasi gen adalah proses dimana DNA asing dimasukkan kedalam sel
tanaman, dimanapara pemulian tanaman dapat memasukkan gen asing kedalam sel atau jaringan
tanaman, baik secara langsung maupun tak langsung tanpa merujuk kepada tingkat
hubungan genetik atau kompatibelilitas suatu jenis. Teknologi pemindahan
gen atau transfer gen dapat dibedakan menjadi dua, yaitu langsung dan tidak
langsung. Contoh transfer gen secara langsung adalah perlakuan pada protoplas tanaman
dengan eletroporasi atau dengan polyethyleneglycol (PEG),
penembakan eksplan gen dengan gene gun atau di vortex dengan
karbit silikon. Teknik pemindahan gen secara tak langsung dilakukan dengan
bantuan bakteri Agrobacterium. Dari banyak teknik transfer gen
yang berkembang, teknik melalui media vektorA. tumefaciens paling
sering digunakan untuk metransformasi tanaman, terutama tanaman kelompok
dikotil. Bakteri ini mampu mentransfer gen kedalam genom tanaman melalui
eksplan baik yang berupa potongan daun (leaf disc ) atau
bagain lain dari jaringan tanaman yang mempunyai potensi beregenerasi tinggi.(Adis.2010.)
Gen yang ditransfer terletak pada plasmid Ti (tumor inducing ).
Segmen spesifik DNA plasmid Ti disebut T-DNA (transfer DNA ) yang berpindah
dari bakteri ke inti sel tanaman dan berintegrasi kedalam genom tanamn.
Karena A. tumefaciens merupakan patogen tanaman maka Agrobacterium sebagai
vektor yang digunakan untuk transformasi tanaman adalah bakteri dari jenis
plasmid Ti yang dilucuti virulensinya (disarmed), sehingga sel tanaman
yang ditransformasi oleh Agrobacterium dan yang mampu
beregenerasi akan membentuk suatu tanaman sehat hasil rekayasa genetik. Teknik
transformasi melalui media vektor Agrobacterium pada tanaman
dikotil telah berhasil dengan baik tetapi sebaliknya tidak umum digunakan pada
tanaman monokotil. Namun beberapa peneliti telah melaporkan bahwa beberapa
strain Agrobacterium berhasil metransformasi tanaman monokotil
seperti jagung dan padi.
2.2. Proses Transformasi Gen oleh Agrobacterium
tumefaciens
Dasar
dari transformasi genetik oleh Agrobacterium adalah transfer dan integrasi
T-DNA ke dalam genom di dalam inti sel tanaman. T-DNA adalah suatu bagian pada
tumor inducing (Ti) plasmid yang terdapat di dalam sel Agrobacterium.
Ti-plasmid berukuran sekitar 200-800 kbp dan T-region (T-DNA)nya sendiri
berukuran sekitar 10% nya (10-30 kbp). T-region ini dibatasi oleh dua sekuen pembatas (border) yaitu right border dan
left border yang mengapit T-region. Bagian lain dari Ti-plasmid yang
tidak kalah pentingnya adalah vir-region yang mengandung sejumlah gen-gen
virulen (virA, virB, virC, virD, virE, virF,virG dan virH) yang berfungsi
didalam proses transfer T-DNA ke dalam sel tanaman.
Proses
transformasi dimulai dengan melekatnya Agrobacterium pada sel tanaman. Kejadian awal ini dimediasi oleh gen-gen yang
berlokasi pada kromosom bakteri (gen chvA, chvB dan att). Langkah berikutnya
adalah terinduksinya gen-gen pada vir-region oleh suatu signal yang spesifik
didalam sel bakteri sehingga dihasilkan
produk dari expresi gen-gen virulen untuk memproses T-DNA dan
mentransfernya dari dalam sel bakteri. Prosesing dan transfer T-DNA dimediasi
oleh berbagai protein yang dikode pembentukannya oleh gen-gen virulen.
Prosesing T-DNA dimulai dari suatu kejadian memproduksi T-DNA untai tunggal
yang disebut T-strand yang ditransfer ke dalam sel tanaman. Kejadian ini
dimediasi oleh produk dari genvirD1 dan virD2 yang berfungsi memotong T-DNA di
bagian left border dan right border. Salah satu produk yaitu molekul VirD2 tetap
melekat secara kovalen pada 5’ end dari
T-strand dan membentuk apa yang disebut T-complex yang masih setengah jadi.
Pembentukan T-complex ini dilaporkan berfungsi untuk menjaga T-DNA dalam
perjalanannya menuju inti sel tanaman inang. Tahap akhir dari transformasi
genetik oleh Agrobacterium adalah integrasi T-DNA ke dalam genom sel tanaman
inang.
2.3
Transfer T-DNA oleh A. Tumefaciens
kedalam sel tanaman.
Agrobacterium
tumefaciens adalah bakteri tanah yang dapat menyebabkan penyakit tumor pada
beberapa tanaman. Bakteri menginfeksi melalui bagian yang luka pada batang
tanaman dan mengakibatkan tumor pada daerah sekitar akar dan batang tanaman.
Penyebab pembentukan tumor bukan berasal dari bakteri itu sendiri tetapi dari
plasmid yang dikenal dengan plasmid Ti. Ukuran DNA plasmid Ti cukup besar,
berkisar antara 140-235 kb (1 kb = 1000 pasang basa). Selama menginfeksi,
sebagian kecil dari DNA plasmid Ti (15-30 kb), disebut T-DNA, ditransfer
kedalam inti sel tanaman dan tersisipi kedalam DNA inti sel tanaman. Dari sini
T-DNA sudah terintegrasi dan stabil terpelihara dalam genom sel.
T-DNA membawa gen yang bertangung jawab terhadap
pembentukan tumor dan sintesa asam amino yang dikenal sebagai opine. Gen-gen
yang bertanggungjawab untuk transfer T-DNA juga terdapat dalam plasmid Ti yang
disebut gen-gen virulen (gen vir). Infeksi Agrobakterium memerlukan jaringan
tanaman yang luka karena gen vir dapat terinduksi oleh senyawa fenolik yang
dilepaskan ole sel-sel tanaman yang terluka.
Daerah ini merupakan potongan DNA berukuran relatif pendek berisi
urutan 25 pasang basa yang berulang. Setiap potongan DNA yang tersisipi
diantara kedua batas T-DNA akan ditransfer dan diintegrasikan kedalam genom
tanaman. Oleh karena itu plasmid Ti merupakan vektor yang sangat cocok untuk
mengintroduksi gen-gen asing ke dalam sel tanaman.
.
Gambar : Ilustrasi transfer T-DNA oleh A. Tumefaciens kedalam sel tanaman
2.4 Tanaman Kedelai Tahan Penggerek Polong Melalui
Transformasi Genetik Gen
Cry 1AB dengan Vektor Agrobacterium Tumefaciens
Kedelai merupakan tanaman
penting diIndonesia setelah padi dan jagung, yang hingga saat ini untuk memenuhi tingginya
permintaan masih perlu dilakukan
impor dalam jumlah yang sangat
tinggi.Kebutuhan kedelai Indonesia
meningkat hingga mencapai 2.24
juta setiap tahunnya, padahal produksi
kedelai nasional pada
tahun 2000 saja, hanya
mencapai 1.19 juta ton. Hingga
tahun 2000, Indonesia mengimpor
kedelai 342.124 ton per tahun
dan menghabiskan devisa sebesar USD
200-300 juta (Biro Pusat Statistik Indonesia
2002). Upaya
peningkatan produksi kedelai di Indonesia
terkendala oleh beberapa faktor,
diantaranya adalah tingginya serangan
hama penggerek polong kedelai
(Etiella zinkenella). Serangan hama
ini dapat menurunkan hasil hingga 20-40
% pada areal pertanaman sekitar 11.000
ha setiap tahunnya, bahkan mencapai 90 % apabila tidak dilakukan pengendalian (Nurdin et al., 1995). Serangan hama ini dapat diatasi dengan penggunaan insektisida kimia. Namun demikian, penggunaan fungisida inimenjadi tidak
efektif apabila dilakukan pada
daerah dengan tingkat serangan yang
sangat tinggi. Selain itu penggunaan
fungisida yang terus menerus dapat
menyebabkan pencemaran
lingkungan dan timbulnya resistensi
serangga terhadap bahan kimia.
Upaya yang aman dan efektif untuk mengatasi hama tersebut adalah dengan perakitan kultivar kedelai yang tahan terhadap hama penggerek polong. Salah satu upaya yang dapat dilakukan untuk merakit tanaman kedelai tahan hama penggerek polong adalah dengan membentuk tanaman kedelai transgenic dengan menggunakan metode transformasi gen. Transformasi gen pada tanaman dapat dilakukan dengan dua cara yaitu transformasi secara langsung meliputi metode mikroinjeksi DNA, elektroforasi, fusi protoplas dan particle bombardment, serta transformasi
tidak langsung dengan bantuan
vektor Agrobacterium tumefaciens
yang merupakan
bakteri obligat gram
negatif yang hidup alami di
tanah. Transformasi tidak langsung melalui
A. tumefaciens memanfaatkan vektor ganda dengan dua plasmid (plasmid biner).
A. tumefaciens yang dilengkapi
dengan plasmid biner mampu
memindahkan gen asing dan mengintegrasikannya
ke dalam genom tanaman (Smith
& Hood, 1995). Klon gen yang
sudah banyak diteliti dalam
usaha mengatasi serangan hama dari
ordo Lepidoptera adalah gen Cry yang
merupakan penyandi protein aktifanti serangga yang diisolasi dari bakteri Bacillus thuringiensis (Bt). Gen ini menghasilkan
kristal protein yang bersifat racun
bila terhidrolisis dalam jaringan
usus serangga. Bt yang dikode oleh
Cry1Ab terbukti efektif terhadap hama ordo Lepidoptera (Wunn et al.1996). Transformasi gen Cry untuk perakitan tanaman tahan hama Lepidoptera telahberhasil dilakukan
pada tanaman jagung (Jagung Bt tahan
penggerek batang), tanaman kapas
(kapas Bt tahan penggerek buah),
dan tanaman padi (padi Bt tahan
penggerek batang).
Saat ini beberapa tanaman transgenik seperti kentang, kapas, dan jagung telah dilepas secara komersial di Indonesia (Loedin et al. 1998). Studi mengenai
transformasi gen Cry1AB pada tanaman kedelai di Indonesia belum banyak dilakukan. Penelitian ini bertujuan untuk mengetahui tingkat keberhasilan transformasi gen Cry1AB kedalam Perakitan Tanaman Kedelai Tahan Penggerek Polong tanaman kedelai dengan menggunakanvektor Agrobacterium
tumefaciens.
Kedelai tahan penggerek polong dengan transformasi genetik gen cry1Ab dengan vector Agrobacterium
tumefaciens. Transformasi
gen Cry1AB pada eksplan dua
varietas kedelai. Transformasi gen pada tanaman dapat dilakukan dengan dua cara yaitu transformasi secara langsung meliputi metode mikro injeksi DNA,
elektroforasi, fusi protoplas dan transformasi
tidak langsung dengan bantuan
vektor Agrobacterium tumefaciens
yang merupakan
bakteri obligat gram
negatif yang hidup alami di
tanah. Transformasi tidak langsung melalui
A. tumefaciens memanfaatkan vektor
ganda dengan dua plasmid (plasmid
biner). A.tumefaciens yang dilengkapi
dengan plasmid mampu memindahkan gen asing ke dalam genom tanaman.
transformasi gen Cry1AB pada tanaman kedelai di Indonesia
belum banyak dilakukan. transformasi
gen Cry1AB kedalam Perakitan Tanaman Kedelai Tahan Penggerek Polong
tanaman kedelai
dengan menggunakan vektor Agrobacterium tumefaciens
Transformasi pada tanaman kedelai dibutuhkan pengetahuan dan kemampuan baik dalam bidang kultur jaringan maupun transformasi. Salah satu hambatan yang paling besar dalam transformasi adalah respon dari tanaman kedelai pada saat manipulasi kultur in vitro. Pertumbuhan
semua eksplan yang berasal dari
kotiledon tua tanaman kedelai
setelah ditransformasi dengan A.tumefaciens
tampak normal.
Selain faktor seleksi,
kecilnya kemungkinan terjadinya
transformasi yang diperoleh juga
disebabkan oleh faktor kontaminasi dari
jamur mulai dari media ke media kokultivasi
sampai dengan media seleksi. Transformasi pada tanaman legume
lebih sulit dilakukan dibandingkan
dengan tanaman lain sehingga harus
diperhatikan sel target yang
bersifat totipoten, sistem transfer gen
ke dalam sel target, dan system seleksi,
serta teknik identifikasinya.
III.
KESIMPULAN
- Agrobacterium tumefaciens adalah bakteri patogen pada tanaman yang
banyak digunakan untuk memasukkan gen asing ke dalam sel tanaman untuk
menghasilkan suatu tanaman
transgenik.
Secara alami, A. tumefaciens dapat menginfeksi
tanaman dikotiledon melalui bagian
tanaman yang terluka sehingga menyebabkan tumor mahkota empedu (crown gall
tumor).
- Metode
transformasi yang diperantarai oleh Agrobacterium tumefaciens. Bakteri
Agrobacterium tumefaciens dapat menginfeksi tanaman secara alami karena
memiliki plasmid Ti, suatu vektor (pembawa DNA) untuk menyisipkan gen
asing. Di dalam plasmid Ti terdapat gen yang menyandikan sifat virulensi
untuk menyebabkan penyakit tanaman tertentu. Gen asing yang ingin
dimasukkan ke dalam tanaman dapat disisipkan di dalam plasmid Ti.
Selanjutnya, A. tumefaciens secara langsung dapat memindahkan gen pada
plasmid tersebut ke dalam genom (DNA) tanaman. Setelah DNA asing menyatu dengan
DNA tanaman maka sifat-sifat yang diinginkan dapat diekspresikan tumbuhan.
- Di
era transformasi genetik sekarang ini, peran Agrobacterium sangat besar
dalam menghasilkan tanaman yang dimodifikasi untuk mendapatkan sifat yang
diinginkan. Peran Agrobacterium dalam hal ini ialah sebagai pembawa gen (DNA) yang diinginkan.
Agrobacterium tumefaciens merupakan bakteri aerob obligat gram negatif
yang hidup alami di tanah. Bakteri ini banyak menyebabkan penyakit crown
gall (tumor) pada tanaman dikotil. Kemampuannya dalam menyebabkan penyakit
ini berhubungan dengan gen penginduksi tumor yang ada pada plasmid (Ti)
yang dijumpai dalam bakteri tersebut. Dalam sel tumor yang terbentuk
terkandung enzim-enzim yang tidak tampak pada tanaman normal, karena enzim
tersebut hanya dihasilkan oleh sel Agrobacterium. Enzim-enzim tersebut
menghasilkan suatu senyawa gula spesifik yang dinamakan opin. Senyawa opin
ini merupakan makanan bagi Agrobacterium itu sendiri.
